Proje Koleksiyonu
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Güncel Gönderiler
Öğe İnsan ADAMTS-3 gen promotorunun fonksiyonel analizi(TÜBİTAK, 2016) Alper, Meltem; Köçkar, FerayADAMTS (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs) ailesi memelilerde ve omurgasızlarda bulunan ekstraselüler proteinazlardır. ADAMTS’ler prokollajenin amino ucunun işlenmesi, matriks proteoglikanlarından agrekan, versikan ve brevikanın degredasyonu, anjiyogenezin inhibisyonu, kan pıhtılaşma homoeostazisinde önemli rollere sahiptir. ADAMTS-3 temel olarak eklem kıkırdağının spesifik bileşeni olan tip II kollajenin işlenmesini sağlar. Ayrıca osteoartirit, miyokard enfarktüs ve göğüs kanseri gibi bazı patolojik durumlarda da bağlantılı olduğu düşünülmektedir. ADAMTS-3’ün fonksiyonel özellikleri detaylı bir şekilde çalışılmış olmasına rağmen genin transkripsiyonel regülasyonunun nasıl olduğu bilinmemektedir. Bu proje ADAMTS-3 geninin transkripsiyonel regülasyonunu ve bu regülasyonda SP1, USF ve C/EBP? transkripsiyon faktörlerinin rolünü aydınlatmayı hedeflemektedir. Bu kapsamda, transkripsiyonel olarak en aktif bölgenin belirlenmesi amacıyla dört farklı uzunlukta ADAMTS-3 promotor parçası [-1340/+40] [-899/+40], [-576/+40], [-131/+40] lusiferaz vektörüne klonlandı. Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde yapılan geçici transfeksiyon analizleri ile bütün parçaların aktif olduğu ve transkripsiyonel aktivite için en küçük promotor parçasının yeterli olduğu belirlendi. Her iki hücre hattında da 616 bç’lik promotor parçasının [-576/+40] en kuvvetli bazal aktiviteye sahip olduğu belirlendi. 1380 [1340/+40] ve 916 bç’lik [-899/+40] promotor parçalarının Saos-2 hücrelerindeki aktivitesinin MG-63 hücre hattına göre daha düşük olduğu tespit edildi. Biyoinformatik analizlere göre ADAMTS3 promotoru 40bç’lik 5’UTR bölgesi içermektedir ve TATA kutusu bulundurmamaktadır. Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde yapılan ko-transfeksiyon deneyleriyle ADAMTS-3 promotor bölgesinde potansiyel bağlanma motifleri bulunan SP1, USF ve C/EBP? gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS-3 promotor aktivitesini azaltıcı yönde etki gösterdiği belirlendi. Çalışmanın diğer bir kısmında SP1, USF ve C/EBP?’nın Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde geçici aşırı ifadesi sağlanarak ADAMTS-3 ve kollajenlerin (tip I,II III) mRNA seviyelerine olan etkisi qRT-PCR, protein seviyesine olan etkisi de westernblot yöntemiyle belirlendi. Bahsedilen transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS-3 mRNA ve protein düzeyini azalttığı belirlendi.Kollajen tiplerinin ekspresyonlarına olan etkisinin hücre tipine göre farklılık gösterdiği belirlendi. DNA-protein etkileşim çalışmalarında ise, SP1,C/EBP?,USF,AP1,E2F,NF?? ve STAT transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS-3 promotor bölgesine fonksiyonel olarak bağlandığı EMSA deneyleri ile belirlendi. Ayrıca Saos, MG-63, Panc, HUVEC, PC-3 ve DU-145 hücre hatlarında ADAMTS-3 mRNA ekspresyon seviyeleri de RT-PCR ile belirlendi. Sonuç olarak bu çalışma ile insan ADAMTS-3 promotoru ilk kez klonlandı ve fonksiyonel olarak analizi yapıldı.SP1, USF ve C/EBP? transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS3’ün ve kollajenlerin (tip I, II, III) transkripsiyonel regülasyonuna olan etkisi belirlenerek literatüre önemli katkılar sağlanmış oldu.
